Ihe na-eme ka ihe na-eme ka ihe na-eme ka ihe na-eme ka ihe na-eme ka ihe na-eme ka ihe na-eme ka ihe na-eme ka ihe na-eme ka ihe na-eme ka ihe na-eme ka ihe na-eme ka ihe ghara ịdị mma.

Uto nke stuck apical meristem (SAM) dị oke mkpa maka nhazi osisi.gibberellins(GAs) na-arụ ọrụ dị mkpa n'ịhazi uto osisi, mana ọrụ ha na SAM ka a na-aghọtachaghị nke ọma. N'ebe a, anyị mepụtara ihe mmetụta ratiometric nke mgbaama GA site n'ịmepụta protein DELLA iji gbochie ọrụ nchịkwa dị mkpa ya na nzaghachi akwụkwọ GA ma na-echekwa mmebi ya mgbe a matachara GA. Anyị na-egosi na ihe mmetụta bio nke dabere na mbibi a na-edekọ mgbanwe na ọkwa GA na mmetụta sel n'oge mmepe. Anyị jiri ihe mmetụta bio a maapụ ọrụ mgbaama GA na SAM. Anyị na-egosi na akara GA dị elu dị na sel dị n'etiti organ primordia, nke bụ ihe ndị na-ebute mkpụrụ ndụ internode. Site na iji ụzọ uru na ọnwụ nke ọrụ, anyị na-egosikwa na GA na-achịkwa ntụzịaka nke mbara nkewa sel, na-eguzobe nhazi sel canonical nke internodes, si otú a na-akwalite nkọwapụta internode na SAM.
Ebe a na-akụ osisi apical meristem (SAM), nke dị n'elu osisi apical, nwere obere mkpụrụ ndụ osisi nke ọrụ ha na-emepụta akụkụ ahụ dị n'akụkụ na akụkụ osisi n'ụzọ dị iche iche na nke na-agbanwe agbanwe n'oge ndụ osisi ahụ. Nke ọ bụla n'ime otu osisi ndị a na-emegharị emegharị, ma ọ bụ akụkụ osisi, gụnyere internodes na akụkụ akụkụ dị n'akụkụ na akụkụ ahụ, na axillary meristems na axils akwụkwọ. Uto na nhazi nke akụkụ osisi na-agbanwe n'oge mmepe. Na Arabidopsis, a na-egbochi uto internodal n'oge oge ahịhịa, axillary meristems na-anọkwa n'ọnọdụ ụra n'axils nke akwụkwọ rosette. N'oge mgbanwe gaa na oge okooko osisi, SAM na-aghọ inflorescence meristem, na-emepụta internodes ogologo na axillary buds, alaka na axils nke akwụkwọ cauline, na mgbe e mesịrị, okooko osisi na-enweghị akwụkwọ2. Ọ bụ ezie na anyị emeela ọganihu dị ukwuu n'ịghọta usoro ndị na-achịkwa mmalite nke akwụkwọ, okooko osisi, na alaka, a maghị ihe dị ukwuu gbasara otu internodes si apụta.
Ịghọta nkesa nke GAs nke oge dị anya ga-enyere aka ịghọta ọrụ nke homonụ ndị a n'ime anụ ahụ dị iche iche na n'ọkwa mmepe dị iche iche. Ịhụ ihe ngosi nke mmebi nke njikọ RGA-GFP nke a na-egosipụta n'okpuru ọrụ nke onye na-akwalite ya na-enye ozi dị mkpa na nhazi nke ọkwa GA zuru oke na mgbọrọgwụ15,16. Agbanyeghị, ngosipụta RGA dịgasị iche na anụ ahụ17 ma GA18 na-achịkwa ya. Ya mere, ngosipụta dị iche iche nke onye na-akwalite RGA nwere ike ibute ụkpụrụ fluorescence a hụrụ na RGA-GFP, yabụ usoro a abụghị ọnụọgụ. N'oge na-adịbeghị anya, GA19,20 nke nwere akara bioactive fluorescein (Fl) kpughere mkpokọta GA na endocortex mgbọrọgwụ na nhazi nke ọkwa sel ya site na njem GA. N'oge na-adịbeghị anya, ihe mmetụta GA FRET nlsGPS1 gosiri na ọkwa GA na-ejikọta na ogologo sel na mgbọrọgwụ, eriri, na hypocotyls21 gbara ọchịchịrị. Agbanyeghị, dịka anyị hụrụla, ntinye GA abụghị naanị paramita na-achịkwa ọrụ mgbaàmà GA, ebe ọ dabere na usoro nchọpụta dị mgbagwoju anya. N'ebe a, site n'ịghọta ụzọ mgbaama DELLA na GA, anyị na-akọ akụkọ mmepe na njirimara nke ihe mmetụta ratiometric dabere na mbibi maka mgbaama GA. Iji mepụta ihe mmetụta biosensor a dị ukwuu, anyị jiri RGA nwere mmetụta GA nke a gwakọtara na protein fluorescent ma gosipụta ya ebe niile n'anụ ahụ, yana protein fluorescent GA nke na-adịghị emetụta GA. Anyị na-egosi na njikọ protein RGA nke a na-akpọ mutant anaghị egbochi mgbaama GA nke a na-akpọ endogenous mgbe a na-egosipụta ya ebe niile, nakwa na ihe mmetụta biosensor a nwere ike ịchọpụta ọrụ mgbaama sitere na ntinye GA na nhazi mgbaama GA site na ngwa mmetụta nwere mkpebi spatiotemporal dị elu. Anyị jiri ihe mmetụta biosensor a mee eserese nkesa spatiotemporal nke ọrụ mgbaama GA ma tụọ otu GA si achịkwa omume sel na epidermis SAM. Anyị na-egosi na GA na-achịkwa nhazi nke usoro nkewa nke sel SAM dị n'etiti organ primordia, si otú a na-akọwa nhazi sel canonical nke internode.
N'ikpeazụ, anyị jụrụ ma qmRGA nwere ike ịkọ mgbanwe na ọkwa GA nke sitere na mkpụrụ ndụ ihe nketa site na iji hypocotyls na-eto eto. Anyị gosiri na nitrate na-akpali uto site na ịbawanye njikọ GA na, n'aka nke ya, mbibi DELLA34. N'ihi ya, anyị hụrụ na ogologo hypocotyl na mkpụrụ osisi pUBQ10::qmRGA nke a kụrụ n'okpuru oke nitrate (10 mM NO3−) dị ogologo karịa nke osisi ndị a kụrụ n'okpuru ọnọdụ enweghị nitrate (Foto mgbakwunye 6a). N'ikwekọ na nzaghachi uto, akara GA dị elu na hypocotyls nke mkpụrụ osisi ndị a kụrụ n'okpuru ọnọdụ 10 mM NO3− karịa na mkpụrụ osisi ndị a kụrụ n'enweghị nitrate (Foto mgbakwunye 6b, c). Ya mere, qmRGA na-enyekwa aka nleba anya nke mgbanwe na mgbaàmà GA nke mgbanwe endogenous na mkpokọta GA kpatara.
Iji ghọta ma ọrụ mgbaàmà GA nke qmRGA chọpụtara dabere na mkpokọta GA na nghọta GA, dịka a tụrụ anya ya dabere na nhazi sensọ, anyị nyochachara ngosipụta nke ndị nnata GID1 atọ na anụ ahụ ahịhịa na ọmụmụ nwa. Na mkpụrụ osisi, ahịrị onye nta akụkọ GID1-GUS gosiri na GID1a na c gosipụtara nke ọma na cotyledons (Fig. 3a–c). Na mgbakwunye, a na-egosipụta ndị nnata atọ niile na akwụkwọ, mgbọrọgwụ primordia n'akụkụ, nsọtụ mgbọrọgwụ (ma e wezụga okpu mgbọrọgwụ nke GID1b), na sistemụ akwara (Fig. 3a–c). Na okooko osisi SAM, anyị chọpụtara akara GUS naanị maka GID1b na 1c (Fig. 7a–c). In situ hybridization kwadoro ụkpụrụ ngosipụta ndị a ma gosikwara na a na-egosipụta GID1c n'otu n'otu na ọkwa dị ala na SAM, ebe GID1b gosipụtara ngosipụta dị elu na mpụta nke SAM (Fig. 7d–l). Njikọ ntụgharị pGID1b::2xmTQ2-GID1b kpughekwara oke ngosipụta nke GID1b, site na obere ma ọ bụ enweghị ngosipụta n'etiti SAM ruo na nnukwu ngosipụta na ókèala akụkụ ahụ (Foto mgbakwunye 7m). Ya mere, ndị na-anabata GID1 anaghị ekesa n'otu aka ahụ n'ofe na n'ime anụ ahụ. Na nnwale ndị sochirinụ, anyị hụkwara na oke ngosipụta nke GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) mụbara mmetụta nke qmRGA na hypocotyls na ngwa GA mpụga (Foto 3d, e). N'ụzọ dị iche, fluorescence nke a tụrụ site na qd17mRGA na hypocotyl enweghị mmetụta na ọgwụgwọ GA3 (Foto 3f, g). Maka nyocha abụọ ahụ, a na-agwọ mkpụrụ osisi na nnukwu mkpokọta nke GA (100 μM GA3) iji nyochaa omume ngwa ngwa nke ihe mmetụta ahụ, ebe ikike ijikọ na onye na-anabata GID1 ka mma ma ọ bụ furu efu. N'ịgụkọ, nsonaazụ ndị a na-egosi na ihe na-eme ka ... dị n'ime ihe na-eme ka ihe na-eme ka ihe dị n'ime ihe na-eme ka ihe dị n'ime ihe na-eme ka ihe dị n'ime ihe na-eme ka ihe dị n'ime ihe na-eme ka ihe dị n'ime ihe na-eme ka ihe dị n'ime ihe na-eme ka ihe dị n'ime ihe na-eme ka ihe dị n'ime ihe na-eme ka ihe dị n'ime ihe na-eme ka ihe dị n'ime ihe na-eme ka ihe dị n'ime ihe na-eme ka ihe dị n'ime ihe na-eme ka ihe dị n'ime ihe
Ruo taa, nkesa nke akara GA na SAM ka edoghị anya. Ya mere, anyị jiri osisi na-egosipụta qmRGA na pCLV3::mCherry-NLS stem cell reporter35 gbakọọ maapụ ọnụọgụgụ dị elu nke ọrụ mgbaàmà GA, na-elekwasị anya na oyi akwa L1 (epidermis; Fig. 4a, b, lee Usoro na Usoro Mgbakwunye), ebe L1 na-arụ ọrụ dị mkpa n'ịchịkwa uto SAM36. N'ebe a, ngosipụta pCLV3::mCherry-NLS nyere ebe ntụaka geometric edobere maka inyocha nkesa spatiotemporal nke ọrụ mgbaàmà GA37. Ọ bụ ezie na a na-ewere GA dị ka ihe dị mkpa maka mmepe akụkụ ahụ n'akụkụ4, anyị hụrụ na akara GA dị ala na primordium okooko osisi (P) malite na ọkwa P3 (Fig. 4a, b), ebe primordium P1 na P2 na-eto eto nwere ọrụ dị mma yiri nke dị na mpaghara etiti (Fig. 4a, b). Achọpụtara ọrụ mgbaàmà GA dị elu na ókèala organ primordium, malite na P1/P2 (n'akụkụ ókèala) ma na-arị elu na P4, yana na sel niile nke mpaghara mpụta dị n'etiti primordia (Fig. 4a, b na Fig. Mgbakwunye 8a, b). A hụrụ ọrụ mgbaàmà GA dị elu a ọ bụghị naanị na epidermis kamakwa na oyi akwa L2 na elu L3 (Fig. Mgbakwunye 8b). Usoro nke mgbaàmà GA achọpụtara na SAM site na iji qmRGA anọgideghịkwa agbanwe agbanwe ka oge na-aga (Fig. Mgbakwunye 8c–f, k). Ọ bụ ezie na e belatara ihe owuwu qd17mRGA n'usoro na SAM nke osisi T3 site na ahịrị ise nọọrọ onwe ha nke anyị kọwara n'ụzọ zuru ezu, anyị nwere ike inyocha ụkpụrụ fluorescence enwetara na pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP construction (Fig. Mgbakwunye 8g–j, l). N'ahịrị njikwa a, naanị obere mgbanwe dị na oke fluorescence ka achọpụtara na SAM, mana n'etiti SAM anyị hụrụ mbelata doro anya na nke a na-atụghị anya ya na VENUS metụtara TagBFP. Nke a na-akwado na usoro mgbaàmà nke qmRGA hụrụ na-egosipụta mmebi nke mRGA-VENUS dabere na GA, mana ọ na-egosikwa na qmRGA nwere ike ịtụle ọrụ mgbaàmà GA karịa na etiti meristem. Na nchịkọta, nsonaazụ anyị na-ekpughe ụkpụrụ mgbaàmà GA nke na-egosipụta nkesa nke primordia. Nkesa a nke mpaghara inter-primordial (IPR) bụ n'ihi mmalite nke ọrụ mgbaàmà GA dị elu n'etiti primordium na-etolite na mpaghara etiti, ebe n'otu oge ahụ ọrụ mgbaàmà GA na primordium na-ebelata (Fig. 4c, d).
Nkesa nke ndị nnata GID1b na GID1c (lee n'elu) na-egosi na ngosipụta dị iche iche nke ndị nnata GA na-enyere aka ịkpụzi ụdị ọrụ mgbaàmà GA na SAM. Anyị na-eche ma mkpokọta dị iche iche nke GA nwere ike itinye aka. Iji nyochaa ohere a, anyị jiri nlsGPS1 GA FRET sensor21. Achọpụtara mmụba ugboro ugboro mkpali na SAM nke nlsGPS1 ejiri 10 μM GA4+7 gwọọ maka nkeji 100 (Foto mgbakwunye 9a–e), na-egosi na nlsGPS1 na-aza mgbanwe na ntinye GA na SAM, dịka ọ na-eme na roots21. Nkesa oghere nke ugboro ugboro mkpali nlsGPS1 kpughere ọkwa GA dị ala na akwa mpụta nke SAM, mana gosiri na ha dị elu n'etiti na n'ókèala SAM (Foto 4e na Fig Mgbakwunye 9a,c). Nke a na-egosi na a na-ekesakwa GA na SAM yana ụkpụrụ oghere yiri nke qmRGA kpughere. Dịka ụzọ mgbakwunye, anyị jikwa SAM mee ihe site na iji fluorescent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ma ọ bụ Fl naanị dị ka njikwa na-adịghị mma. E kesara mgbaàmà Fl n'ime SAM niile, gụnyere mpaghara etiti na primordium, n'agbanyeghị na ọ dị obere ike (Fig. 4j na Mgbakwunye Fig. 10d). N'ụzọ dị iche, GA-Fl atọ niile gbakọtara kpọmkwem n'ime ókèala primordium na n'ogo dị iche iche na IPR ndị ọzọ, ebe GA7-Fl na-agbakọta na ngalaba kachasị na IPR (Fig. 4k na Mgbakwunye Fig. 10a,b). Ngụkọta nke ike fluorescence gosiri na oke ike IPR na nke na-abụghị IPR dị elu na SAM ejiri GA-Fl gwọọ ma e jiri ya tụnyere SAM ejiri Fl gwọọ (Fig. 4l na Mgbakwunye Fig. 10c). N'ịgụkọta, nsonaazụ ndị a na-egosi na GA dị na oke njupụta dị elu na mkpụrụ ndụ IPR nke dị nso na ókè akụkụ ahụ. Nke a na-egosi na usoro nke ọrụ mgbaàmà SAM GA sitere na ngosipụta dị iche iche nke ndị na-anabata GA na mkpokọta dị iche iche nke GA na mkpụrụ ndụ IPR dị nso na ókèala akụkụ ahụ. Ya mere, nyocha anyị kpughere usoro spatiotemporal a na-atụghị anya ya nke mgbaàmà GA, yana obere ọrụ na etiti na primordium nke SAM na ọrụ dị elu na IPR na mpaghara dị n'akụkụ.
Iji ghọta ọrụ nke ọrụ mgbaama GA dị iche iche na SAM, anyị nyochara njikọ dị n'etiti ọrụ mgbaama GA, mgbasawanye sel, na nkewa sel site na iji onyonyo oge-oge nke SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. N'inye ọrụ nke GA na nhazi uto, a tụrụ anya njikọ dị mma na paramita mgbasawanye sel. Ya mere, anyị buru ụzọ tụnyere maapụ ọrụ mgbaama GA na maapụ nke ọnụego uto elu sel (dị ka ihe nnọchi anya maka ike nke mgbasawanye sel maka mkpụrụ ndụ enyere na maka mkpụrụ ndụ nwa nwanyị na nkewa) yana maapụ anisotropy uto, nke na-atụ ntụzịaka nke mgbasawanye sel (ejikwara ebe a maka mkpụrụ ndụ enyere na maka mkpụrụ ndụ nwa nwanyị na nkewa; Fig. 5a,b, lee Usoro na Usoro Mgbakwunye). Maapụ anyị nke ọnụego uto elu sel SAM kwekọrọ na ihe ndị gara aga38,39, yana obere ọnụego uto na ókèala na ọnụego uto kachasị na okooko osisi na-etolite (Fig. 5a). Nyocha akụkụ bụ isi (PCA) gosiri na ọrụ mgbaama GA nwere njikọ na-adịghị mma na ike uto elu sel (Foto 5c). Anyị gosikwara na isi ihe dị iche iche, gụnyere ntinye akara GA na ike uto, bụ nke a na-ahụ anya n'akụkụ nke e ji okwu CLV3 dị elu chọpụta, na-akwado mwepụ nke mkpụrụ ndụ site na etiti SAM na nyocha ndị ọzọ. Nyocha njikọ Spearman kwadoro nsonaazụ PCA (Foto 5d), na-egosi na akara GA dị elu na IPR emeghị ka mkpụrụ ndụ dịkwuo elu. Agbanyeghị, nyocha njikọ kpughere obere njikọ dị mma n'etiti ọrụ akara GA na anisotropy uto (Foto 5c, d), na-egosi na akara GA dị elu na IPR na-emetụta ntụziaka nke uto mkpụrụ ndụ na ikekwe ọnọdụ nke mbara nkewa mkpụrụ ndụ.
a, b Maapụ ọkụ nke uto elu nkezi (a) na uto anisotropy (b) na SAM nwere nkezi ihe karịrị osisi asaa nọọrọ onwe ha (ejiri dị ka ihe nnọchi anya maka ike na ntụziaka nke mgbasawanye sel, n'otu n'otu). c Nyocha PCA gụnyere mgbanwe ndị a: mgbaàmà GA, ike uto elu, uto anisotropy, na ngosipụta CLV3. Akụkụ PCA 1 jikọtara ya na ike uto elu ma jikọta ya nke ọma na mgbaàmà GA. Akụkụ PCA 2 jikọtara ya na uto elu nke ọma ma jikọta ya na ngosipụta CLV3. Pasentị na-anọchite anya mgbanwe nke akụkụ ọ bụla kọwara. d Nyocha mmekọrịta Spearman n'etiti mgbaàmà GA, ike uto elu, na uto elu anisotropy na nha anụ ahụ ewezụga CZ. Ọnụọgụ dị n'aka nri bụ uru Spearman rho n'etiti mgbanwe abụọ. Akara kpakpando na-egosi ikpe ebe njikọ/adịghị mma dị oke mkpa. e 3D visualization nke mkpụrụ ndụ Col-0 SAM L1 site na confocal microscopy. Mgbidi sel ọhụrụ e guzobere na SAM (mana ọ bụghị primordium) na awa 10 na-agba agba dịka ụkpụrụ nkuku ha si dị. A na-egosi ogwe agba ahụ n'akụkụ aka nri ala. Ihe dị n'ime ya na-egosi onyonyo 3D kwekọrọ na awa 0. Emeghachiri nnwale ahụ ugboro abụọ na nsonaazụ yiri ya. f Ihe osise igbe na-egosi ọnụego nkewa sel na IPR na nke na-abụghị IPR Col-0 SAM (n = osisi iri nọọrọ onwe ha). Ahịrị etiti na-egosi etiti, ókè igbe na-egosi pasentị nke 25 na 75. Akpịrị na-egosi uru kacha nta na nke kachasị elu nke ejiri ngwanrọ R chọpụta. E nwetara uru P site na ule t-ọdụ abụọ nke Welch. g, h Ihe osise eserese na-egosi (g) otu esi atụ akụkụ nke mgbidi sel ọhụrụ (magenta) gbasara ntụziaka radial site na etiti SAM (ahịrị ntụpọ ọcha) (naanị uru akụkụ dị oke njọ, ya bụ, 0-90°, ka a na-atụle), na (h) ntụziaka gburugburu/akụkụ na radial n'ime meristem. i Histogram ugboro ugboro nke nhazi ụgbọelu nkewa sel gafee SAM (acha anụnụ anụnụ gbara ọchịchịrị), IPR (acha anụnụ anụnụ ọkara), na nke na-abụghị IPR (acha anụnụ anụnụ ọkụ), n'otu n'otu. E nwetara ụkpụrụ P site na nnwale Kolmogorov-Smirnov nwere ọdụ abụọ. E meghachiri nnwale ahụ ugboro abụọ ma nweta nsonaazụ yiri ya. j Ugboro histogram nke nhazi nkewa sel nke IPR gburugburu P3 (akwụkwọ ndụ akwụkwọ ndụ dị mfe), P4 (akwụkwọ ndụ akwụkwọ ndụ dị ọkara), na P5 (akwụkwọ ndụ gbara ọchịchịrị), n'otu n'otu. E nwetara ụkpụrụ P site na ule Kolmogorov-Smirnov nwere ọdụ abụọ. E meghachiri nnwale ahụ ugboro abụọ ma nweta nsonaazụ yiri ya.
Ya mere, anyị nyochachara njikọ dị n'etiti mgbaama GA na ọrụ nkewa sel site n'ịchọpụta mgbidi sel ọhụrụ e guzobere n'oge nnwale ahụ (Foto 5e). Ụzọ a nyere anyị ohere ịtụ ugboro na ntụziaka nke nkewa sel. Ihe ijuanya bụ na anyị chọpụtara na ugboro ole nkewa sel dị na IPR na ndị ọzọ nke SAM (na-abụghị IPR, Fig. 5f) yiri nke ahụ, na-egosi na ọdịiche dị na mgbaama GA n'etiti sel IPR na ndị na-abụghị IPR anaghị emetụta nkewa sel nke ukwuu. Nke a, na njikọ dị mma dị n'etiti mgbaama GA na anisotropy uto, kpaliri anyị ịtụle ma ọrụ mgbaama GA nwere ike imetụta ntụzịaka nke mbara nkewa sel. Anyị tụrụ ntụzịaka nke mgbidi sel ọhụrụ ahụ dịka akụkụ dị nkọ ma e jiri ya tụnyere axis radial nke na-ejikọ etiti meristem na etiti mgbidi sel ọhụrụ ahụ (Fig. 5e-i) ma hụ etu mkpụrụ ndụ si kewaa n'akụkụ dị nso na 90° ma e jiri ya tụnyere axis radial, yana ugboro kachasị elu a hụrụ na 70–80° (23.28%) na 80–90° (22.62%) (Fig. 5e,i), nke kwekọrọ na nkewa sel na ntụzịaka gburugburu/transverse (Fig. 5h). Iji lelee onyinye nke mgbaama GA na omume nkewa sel a, anyị nyochachara paramita nkewa sel na IPR na nke na-abụghị IPR iche iche (Fig. 5i). Anyị hụrụ na nkesa akụkụ nkewa na mkpụrụ ndụ IPR dị iche na nke dị na mkpụrụ ndụ ndị na-abụghị IPR ma ọ bụ na mkpụrụ ndụ dị na SAM dum, yana mkpụrụ ndụ IPR na-egosipụta oke dị elu nke nkewa sel n'akụkụ/gburugburu, ya bụ, 70–80° na 80–90° (33.86% na 30.71%, n'otu n'otu, oke kwekọrọ) (Foto 5i). Ya mere, ihe anyị hụrụ gosiri njikọ dị n'etiti mgbaama GA dị elu na nhazi mbara igwe nkewa sel dị nso na ntụziaka gburugburu, yiri njikọ dị n'etiti ọrụ mgbaama GA na anisotropy uto (Foto 5c, d). Iji guzobe nchekwa oghere nke njikọ a, anyị tụrụ nhazi mbara igwe nkewa na mkpụrụ ndụ IPR gbara primordium gburugburu malite na P3, ebe ọ bụ na achọpụtara ọrụ mgbaama GA kachasị elu na mpaghara a malite na P4 (Foto 4). Akụkụ nkewa nke IPR gburugburu P3 na P4 egosighi ọdịiche dị mkpa na ọnụọgụgụ, ọ bụ ezie na a hụrụ mmụba ugboro ugboro nke nkewa sel n'akụkụ na IPR gburugburu P4 (Foto 5j). Agbanyeghị, na mkpụrụ ndụ IPR gbara P5 gburugburu, ọdịiche dị na nhazi nke mbara nkewa sel ghọrọ ihe dị mkpa na ọnụọgụgụ, yana mmụba dị ukwuu na ugboro ole nke nkewa sel transverse (Fig. 5j). N'ịgụkọta, nsonaazụ ndị a na-egosi na mgbaama GA nwere ike ijikwa nhazi nke nkewa sel na SAM, nke kwekọrọ na akụkọ gara aga40,41 na mgbaama GA dị elu nwere ike ịkpalite nhazi nkewa sel n'akụkụ na IPR.
A na-atụ anya na mkpụrụ ndụ dị na IPR agaghị etinye na primordia kama ọ ga-abanye na internodes2,42,43. Nhazi nkewa mkpụrụ ndụ na IPR nwere ike ibute nhazi nkịtị nke ahịrị ogologo nke mkpụrụ ndụ epidermal n'ime internodes. Ihe anyị chọpụtara n'elu na-egosi na mgbaàmà GA nwere ike ịrụ ọrụ na usoro a site n'ịchịkwa ntụziaka nkewa mkpụrụ ndụ.
Mfu nke ọtụtụ mkpụrụ ndụ ihe nketa DELLA na-ebute nzaghachi GA, enwere ike iji della mutants nwalee echiche a44. Anyị buru ụzọ nyochaa usoro ngosipụta nke mkpụrụ ndụ ihe nketa DELLA ise na SAM. Njikọta ntụgharị nke ahịrị GUS45 gosiri na GAI, RGA, RGL1, na RGL2 (ruo obere) ka egosipụtara na SAM (Foto mgbakwunye 11a–d). In situ hybridization gosikwara na GAI mRNA na-agbakọta kpọmkwem na primordia na okooko osisi na-eto eto (Foto mgbakwunye 11e). Achọpụtara mRNA RGL1 na RGL3 n'ofe SAM canopy na na okooko osisi ochie, ebe RGL2 mRNA dị ọtụtụ karịa na mpaghara ókèala (Foto mgbakwunye 11f–h). Confocal onyonyo nke pRGL3::RGL3-GFP SAM kwadoro okwu ahụ a hụrụ site na in situ hybridization ma gosi na protein RGL3 na-agbakọta na akụkụ etiti nke SAM (Foto mgbakwunye 11i). Site n'iji ahịrị pRGA::GFP-RGA, anyị chọpụtakwara na protein RGA na-agbakọta na SAM, mana oke ya na-ebelata na ókèala malite na P4 (Foto mgbakwunye 11j). Ihe dị mkpa bụ na ụkpụrụ ngosipụta nke RGL3 na RGA kwekọrọ na ọrụ mgbaàmà GA dị elu na IPR, dịka qmRGA chọpụtara (Foto 4). Ọzọkwa, data ndị a na-egosi na a na-egosipụta DELLA niile na SAM na na ngosipụta ha na-agbasa SAM dum.
Anyị nyochachara paramita nkewa sel na ụdị SAM wild-type (Ler, control) na gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (Fig. 6a, b). N'ụzọ na-akpali mmasị, anyị hụrụ mgbanwe dị ukwuu na nkesa nke ugboro ugboro nkewa sel na della global mutant SAM ma e jiri ya tụnyere ụdị wild (Fig. 6c). Mgbanwe a na della global mutant bụ n'ihi mmụba na ugboro ugboro nke akụkụ 80–90° (34.71% vs. 24.55%) na, ruo n'ókè dị nta, akụkụ 70–80° (23.78% vs. 20.18%), ya bụ, kwekọrọ na nkewa sel transverse (Fig. 6c). Ugboro nke nkewa ndị na-abụghị transverse (0–60°) dịkwa ala na della global mutant (Fig. 6c). Ugboro nke nkewa mkpụrụ ndụ transverse mụbara nke ukwuu na SAM nke della global mutant (Foto 6b). Ugboro nke nkewa mkpụrụ ndụ transverse na IPR dịkwa elu karịa na della global mutant ma e jiri ya tụnyere ụdị ọhịa (Foto 6d). N'èzí mpaghara IPR, ụdị ọhịa ahụ nwere nkesa nkewa mkpụrụ ndụ n'otu aka ahụ, ebe della global mutant họọrọ nkewa tangential dị ka IPR (Foto 6e). Anyị tụkwara ntụle nke nkewa mkpụrụ ndụ na SAM nke ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutants (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, na ga2ox6-2), ndabere GA-anaghị arụ ọrụ nke GA na-agbakọta. N'ikwekọ na mmụba nke ọkwa GA, SAM nke okooko osisi quintuple ga2ox mutant buru ibu karịa nke Col-0 (Foto mgbakwunye 12a, b), ma e jiri ya tụnyere Col-0, quintuple ga2ox SAM gosipụtara nkesa dị iche iche nke akụkụ nkewa sel, yana ugboro nkuku na-abawanye site na 50° ruo 90°, ya bụ, na-akwado nkewa tangential ọzọ (Foto mgbakwunye 12a–c). Ya mere, anyị na-egosi na mkpali nhazi nke mgbaàmà GA na mkpokọta GA na-akpali nkewa sel n'akụkụ na IPR na ndị ọzọ nke SAM.
a, b Nlereanya 3D nke oyi akwa L1 nke Ler (a) nke nwere ntụpọ PI na nke nwere ntụpọ global della mutant (b) SAM site na iji igwe onyonyo confocal. A na-egosi mgbidi sel ọhụrụ e guzobere na SAM (mana ọ bụghị primordium) n'ime oge awa 10 ma na-agba agba dịka ụkpụrụ akụkụ ha si dị. Ntinye aka na-egosi SAM na awa 0. A na-egosi ogwe agba ahụ n'akụkụ aka nri ala. Akụ dị na (b) na-atụ aka na ihe atụ nke faịlụ sel ahaziri na nke nwere ntụpọ della zuru ụwa ọnụ. Emeghachiri nnwale ahụ ugboro abụọ yana nsonaazụ yiri ya. ntụnyere ce nke nkesa ugboro ugboro nke ntụnyere nkewa sel na SAM (d), IPR (e), na nke na-abụghị IPR (f) n'etiti Ler na nke nwere ntụpọ global della. E nwetara ụkpụrụ P site na iji ule Kolmogorov-Smirnov nwere ọdụ abụọ. f, g Nlereanya 3D nke onyonyo confocal nke SAM nke nwere ntụpọ PI nke Col-0 (i) na pCUC2::gai-1-VENUS (j) osisi transgenic. Panel (a, b) na-egosi mgbidi sel ọhụrụ (mana ọ bụghị primordia) nke e guzobere na SAM n'ime awa 10. Emeghachiri nnwale ahụ ugboro abụọ na nsonaazụ yiri ya. h–j Ntụnyere nkesa ugboro ole nke ntụzịaka nkewa sel dị na SAM (h), IPR (i) na nke na-abụghị IPR (j) n'etiti osisi Col-0 na pCUC2::gai-1-VENUS. E nwetara ụkpụrụ P site na iji ule Kolmogorov-Smirnov nwere ọdụ abụọ.
Anyị nwalechara mmetụta nke igbochi mgbaàmà GA kpọmkwem na IPR. Iji mezuo nke a, anyị jiri cotyledon cup 2 (CUC2) promoter iji kwalite ngosipụta nke protein gai-1 na-adịghị mma nke ejikọtara na VENUS (n'ahịrị pCUC2::gai-1-VENUS). Na SAM ụdị ọhịa, onye na-akwalite CUC2 na-akwalite ngosipụta nke ọtụtụ IPRs na SAM, gụnyere mkpụrụ ndụ ókèala, site na P4 gaa n'ihu, a hụkwara ngosipụta kpọmkwem yiri ya na osisi pCUC2::gai-1-VENUS (lee n'okpuru). Nkesa nke akụkụ nkewa sel n'ofe SAM ma ọ bụ IPR nke osisi pCUC2::gai-1-VENUS adịghị iche nke ukwuu na nke ụdị ọhịa, ọ bụ ezie na anyị chọpụtara na mberede na mkpụrụ ndụ na-enweghị IPR na osisi ndị a kewara na ugboro dị elu nke 80–90° (Fig. 6f–j).
A tụrụ aro na ụzọ nkewa sel dabere na geometry nke SAM, ọkachasị nrụgide tensile nke eriri anụ ahụ na-emepụta46. Ya mere, anyị jụrụ ma ọdịdị SAM agbanweela na della global mutant na pCUC2::gai-1-VENUS osisi. Dịka akọwara na mbụ12, nha nke della global mutant SAM buru ibu karịa nke ụdị anụ ọhịa (Foto mgbakwunye 13a, b, d). In situ hybridization nke CLV3 na STM RNA kwadoro mmụba meristem na della mutants ma gosikwa mmụba n'akụkụ nke niche sel (Foto mgbakwunye 13e, f, h, i). Agbanyeghị, mgbagọ SAM yiri nke ahụ na genotypes abụọ ahụ (Foto mgbakwunye 13k, m, n, p). Anyị hụrụ mmụba yiri nke ahụ na nha na gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant na-enweghị mgbanwe na curvature ma e jiri ya tụnyere ụdị ọhịa (Foto mgbakwunye 13c, d, g, j, l, o, p). Ugboro nke nhazi nkewa sel emetụtakwara na della quadruple mutant, mana ruo n'ókè dị ala karịa na della monolithic mutant (Foto mgbakwunye 12d–f). Mmetụta dose a, yana enweghị mmetụta na curvature, na-egosi na ọrụ RGL3 fọdụrụ na Della quadruple mutant na-egbochi mgbanwe na nhazi nkewa sel nke ọnwụ nke ọrụ DELLA kpatara na mgbanwe na nkewa sel n'akụkụ na-eme na nzaghachi na mgbanwe na ọrụ mgbaàmà GA kama mgbanwe na geometry SAM. Dịka akọwara n'elu, onye na-akwalite CUC2 na-akwalite ngosipụta IPR na SAM site na P4 (Foto mgbakwunye 14a, b), ma n'ụzọ dị iche, pCUC2::gai-1-VENUS SAM nwere nha dị ala mana ọ dị elu karịa (Foto mgbakwunye 14c–h). Mgbanwe a na pCUC2::gai-1-VENUS SAM morphology nwere ike ibute nkesa dị iche nke nrụgide igwe ma e jiri ya tụnyere ụdị ọhịa, ebe nrụgide gburugburu dị elu na-amalite na obere anya site na etiti SAM47. N'aka nke ọzọ, mgbanwe na pCUC2::gai-1-VENUS SAM morphology nwere ike ịpụta site na mgbanwe na njirimara igwe mpaghara nke ngosipụta transgene kpatara48. N'ọnọdụ abụọ a, nke a nwere ike ịkwụsị mmetụta nke mgbanwe na mgbaàmà GA site n'ịbawanye ohere na mkpụrụ ndụ ga-ekewa na nhazi gburugburu/transverse, na-akọwa ihe anyị chọpụtara.
N'ịchịkọta data anyị, data anyị na-egosi na akara ngosi GA dị elu na-arụ ọrụ dị mkpa na nhazi akụkụ nke usoro nkewa sel na IPR. Ha na-egosikwa na mgbagọ meristem na-emetụtakwa nhazi nke usoro nkewa sel na IPR.
Nhazi nke akụkụ nkewa na IPR, n'ihi ọrụ mgbaama GA dị elu, na-egosi na GA na-ahazi faịlụ sel radial na epidermis n'ime SAM tupu oge eruo iji kọwaa nhazi sel nke a ga-ahụ na epidermal internode. N'ezie, a na-ahụkarị faịlụ sel ndị dị otú ahụ na onyonyo SAM nke della global mutants (Fig. 6b). Ya mere, iji nyochaa ọrụ mmepe nke usoro oghere nke mgbaama GA na SAM, anyị jiri onyonyo oge-lapse nyochaa nhazi oghere nke sel na IPR na ụdị ọhịa (Ler na Col-0), della global mutants, na pCUC2::gai-1-VENUS transgenic osisi.
Anyị chọpụtara na qmRGA gosiri na ọrụ mgbaama GA na IPR mụbara site na P1/P2 ma ruo na P4, usoro a nọgidere na-agbanwe agbanwe ka oge na-aga (Foto 4a–f na Foto Mgbakwunye 8c–f, k). Iji nyochaa nhazi oghere nke mkpụrụ ndụ na IPR site na mmụba nke mgbaàmà GA, anyị kpọrọ mkpụrụ ndụ IPR Ler n'elu na n'akụkụ nke P4 dịka akara mmepe ha si dị nyochaa awa 34 mgbe a hụchara nke mbụ, ya bụ, ihe karịrị oge plastid abụọ, na-enye anyị ohere ịgbaso mkpụrụ ndụ IPR n'oge mmepe primordium site na P1/P2 ruo P4. Anyị jiri agba atọ dị iche iche: odo maka mkpụrụ ndụ ndị ahụ etinyere na primordium dị nso na P4, akwụkwọ ndụ akwụkwọ ndụ maka ndị nọ na IPR, na odo odo maka ndị sonyere na usoro abụọ ahụ (Foto 7a–c). Na t0 (0 h), a hụrụ oyi akwa 1–2 nke mkpụrụ ndụ IPR n'ihu P4 (Foto 7a). Dịka a tụrụ anya ya, mgbe mkpụrụ ndụ ndị a kewara, ha mere ya karịsịa site na mbara nkewa transverse (Foto 7a–c). E nwetara ihe ndị yiri ya site na iji Col-0 SAM (na-elekwasị anya na P3, nke ókèala ya na-apịachi otu P4 na Ler), ọ bụ ezie na na genotype a, mpịachi e guzobere na ókèala okooko osisi zoro mkpụrụ ndụ IPR ngwa ngwa (Foto 7g–i). Ya mere, usoro nkewa nke mkpụrụ ndụ IPR na-ahazi mkpụrụ ndụ ndị ahụ tupu oge eruo n'usoro radial, dịka ọ dị na internodes. Nhazi nke ahịrị radial na ebe mkpụrụ ndụ IPR dị n'etiti akụkụ ahụ ndị na-esote na-egosi na mkpụrụ ndụ ndị a bụ ndị mbụ dị n'ime nodal.
N'ebe a, anyị mepụtara ihe na-egosi ihe na-egosi ihe na-egosi ihe na-egosi ihe na-egosi ihe na-eme na GA, qmRGA, nke na-enye ohere maka nhazi ọnụọgụ nke ọrụ mgbaàmà GA sitere na mkpokọta ihe na-anabata GA na GA ma na-ebelata nnyonye anya na ụzọ mgbaàmà endogenous, si otú a na-enye ozi gbasara ọrụ GA na ọkwa sel. Iji mezuo nke a, anyị wuru protein DELLA gbanwere, mRGA, nke furu efu ikike ijikọ ndị mmekọ mmekọrịta DELLA mana ọ ka na-enwe mmetụta na proteolysis nke GA kpatara. qmRGA na-aza ma mgbanwe mpụga na nke endogenous na ọkwa GA, ihe ndị na-egosi mmetụta ya na-enyekwa aka inyocha mgbanwe spatiotemporal na ọrụ mgbaàmà GA n'oge mmepe. qmRGA bụkwa ngwaọrụ dị mfe n'ihi na enwere ike ịgbanwe ya na anụ ahụ dị iche iche site na ịgbanwe onye na-akwalite ihe eji eme ihe maka ngosipụta ya (ọ bụrụ na ọ dị mkpa), ma ebe ọ bụ na e chekwara ọdịdị nke ụzọ mgbaàmà GA na motif PFYRE n'ofe angiosperms, o yikarịrị ka enwere ike ibufe ya na ụdị ndị ọzọ22. N'ikwekọ na nke a, a gosikwara na mgbanwe nhata na protein osikapa SLR1 DELLA (HYY497AAA) na-egbochi ọrụ mgbochi uto nke SLR1 ebe ọ na-ebelata ntakịrị mmebi GA ya, nke yiri mRGA23. Ihe pụrụ iche bụ na ọmụmụ ihe ndị e mere n'oge na-adịbeghị anya na Arabidopsis gosiri na otu mgbanwe amino acid na ngalaba PFYRE (S474L) gbanwere ọrụ ntụgharị nke RGA na-enweghị mmetụta ya na ikike ya iso ndị mmekọ ntụgharị ihe 50 na-akpakọrịta. Ọ bụ ezie na mgbanwe a dị nnọọ nso na nnọchi amino acid atọ dị na mRGA, ọmụmụ ihe anyị na-egosi na mgbanwe abụọ a na-agbanwe njirimara dị iche iche nke DELLA. Ọ bụ ezie na ọtụtụ ndị mmekọ ntụgharị ihe na-ejikọta na ngalaba LHR1 na SAW nke DELLA26,51, ụfọdụ amino acid echekwara na ngalaba PFYRE nwere ike inyere aka mee ka mmekọrịta ndị a sie ike.
Mmepe internode bụ ihe dị mkpa na nhazi osisi na mmezi mmepụta. qmRGA kpughere ọrụ mgbaama GA dị elu na mkpụrụ ndụ progenitor IPR. Site na ijikọta onyonyo ọnụọgụgụ na mkpụrụ ndụ ihe nketa, anyị gosiri na ụkpụrụ mgbaama GA na-achịkwa mbara igwe nkewa sel gburugburu/transverse na SAM epidermis, na-akpụzi nhazi nkewa sel achọrọ maka mmepe internode. Achọpụtala ọtụtụ ndị na-achịkwa nhazi nkewa sel plane n'oge mmepe52,53. Ọrụ anyị na-enye ihe atụ doro anya nke otu ọrụ mgbaama GA si achịkwa paramita sel a. DELLA nwere ike iso mgbagwoju protein prefolding41 na-akpakọrịta, yabụ mgbaama GA nwere ike ijikwa nhazi nkewa sel site na imetụta ozugbo cortical microtubule reference40,41,54,55. Anyị gosiri na mberede na SAM, njikọ nke ọrụ mgbaama GA dị elu abụghị ịgbatị ma ọ bụ nkewa sel, kama ọ bụ naanị uto anisotropy, nke kwekọrọ na mmetụta kpọmkwem nke GA na ntụziaka nkewa sel na IPR. Agbanyeghị, anyị enweghị ike iwepụ na mmetụta a nwekwara ike ịbụ nke na-apụtaghị ìhè, dịka ọmụmaatụ nke GA kpatara mgbidi sel softening56. Mgbanwe na ihe ndị dị na mgbidi sel na-akpata nrụgide mekanikal57,58, nke nwekwara ike imetụta ntụzịaka nke akụkụ nkewa sel site na imetụta ntụzịaka nke microtubules cortical39,46,59. Mmetụta dị iche iche nke nrụgide mekanikal nke GA kpatara na nhazi kpọmkwem nke ntụzịaka microtubule site na GA nwere ike itinye aka na imepụta usoro kpọmkwem nke ntụzịaka nkewa sel na IPR iji kọwaa internodes, a chọkwara ọmụmụ ihe ndị ọzọ iji nwalee echiche a. N'otu aka ahụ, ọmụmụ ihe ndị gara aga egosila mkpa protein ndị na-emekọrịta ihe na DELLA TCP14 na 15 na njikwa nhazi internode60,61 na ihe ndị a nwere ike ịkpalite ọrụ nke GA yana BREVIPEDICELLUS (BP) na PENNYWISE (PNY), nke na-achịkwa mmepe internode ma egosila na ha na-emetụta akara GA2,62. Ebe ọ bụ na DELLA na-emekọrịta ihe na brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, na ụzọ mgbaama abscisic acid (ABA)63,64 na na homonụ ndị a nwere ike imetụta ntụzịaka microtubule65, mmetụta nke GA na ntụzịaka nkewa sel nwekwara ike ịbụ nke homonụ ndị ọzọ na-akwado.
Ọmụmụ ihe gbasara mkpụrụ ndụ ihe nketa mbụ gosiri na mpaghara ime na mpụta nke Arabidopsis SAM dị mkpa maka mmepe internode2,42. Eziokwu ahụ bụ na GA na-achịkwa nkewa sel n'ime anụ ahụ12 na-akwado ọrụ abụọ nke GA n'ịchịkwa nha meristem na internode na SAM. A na-achịkwakwa ụkpụrụ nkewa sel ntụziaka nke ọma na anụ ahụ SAM dị n'ime, iwu a dịkwa mkpa maka uto stem52. Ọ ga-amasị m inyocha ma GA na-arụkwa ọrụ n'ịhazi ụgbọelu nkewa sel n'ime nhazi SAM dị n'ime, si otú a na-eme ka nkọwapụta na mmepe nke internodes dị n'ime SAM.
A kụrụ osisi n'ime ala ma ọ bụ 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) nke ejiri 1% sucrose na 1% agar (Sigma) mee ihe n'okpuru ọnọdụ ọkọlọtọ (awa 16 ìhè, 22 °C), ma e wezụga nnwale hypocotyl na mgbọrọgwụ nke e ji kụọ mkpụrụ osisi n'elu efere kwụ ọtọ n'okpuru ìhè na-adịgide adịgide na 22 °C. Maka nnwale nitrate, a kụrụ osisi na MS medium (bioWORLD plant medium) nke ejiri nitrate zuru oke (0 ma ọ bụ 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose na 1% A-agar (Sigma) mee ihe n'okpuru ọnọdụ ogologo ụbọchị.
E jiri pDONR P4-P1R-pUBQ10 jikọta GID1a cDNA nke etinyere na pDONR221 na pDONR P2R-P3-mCherry n'ime pB7m34GW iji mepụta pUBQ10::GID1a-mCherry. E jiri DNA IDD2 nke etinyere na pDONR221 jikọta na pB7RWG266 iji mepụta p35S:IDD2-RFP. Iji mepụta pGID1b::2xmTQ2-GID1b, e buru ụzọ mee ka iberibe 3.9 kb dị n'elu mpaghara koodu GID1b na iberibe 4.7 kb nwere GID1b cDNA (1.3 kb) na terminator (3.4 kb) dịkwuo elu site na iji primers dị na Mgbakwunye Tebụl 3 wee tinye ya na pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) na pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), n'otu n'otu, ma mesịa jikọta ya na pDONR221 2xmTQ268 na vektọ ebumnuche pGreen 012567 site na iji cloning Gateway. Iji mepụta pCUC2::LSSmOrange, usoro nkwalite CUC2 (3229 bp n'elu ATG) wee soro usoro koodu nke nnukwu Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 yana akara localization nuklia N7 na terminator transcriptional NOS chịkọtara n'ime vektọ kanamycin pGreen site na iji usoro recombination nke Gateway 3-fragment (Invitrogen). E tinyere vektọ binary osisi ahụ n'ime ụdị Agrobacterium tumefaciens GV3101 ma tinye ya n'ime akwụkwọ Nicotiana bentamiana site na usoro Agrobacterium infiltration na n'ime Arabidopsis thaliana Col-0 site na usoro floral dip, n'otu n'otu. E kewapụrụ pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry na pCLV3::mCherry-NLS qmRGA site na ụmụ F3 na F1 nke obe dị iche iche, n'otu n'otu.
E mere njikọ RNA in situ na ihe dị ka 1 cm ogologo nke tips72, nke a chịkọtara ma dozie ozugbo na mmiri FAA (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) tupu oge eruo ruo 4 °C. Mgbe ọgwụgwọ vacuum nkeji 2 × 15 gasịrị, agbanwere ihe ndozi ahụ ma tinye ihe nlele n'ime akpa ahụ n'abalị. E jiri ihe ndị e gosiri na Tebụl Mgbakwunye 3 mepụta GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, na RGL3 cDNAs na ihe nyocha antisense na 3′-UTRs ha dịka Rosier et al.73 si kọwaa. E jiri ọgwụ mgbochi digoxigenin (mpịakọta 3000; Roche, nọmba katalọgụ: 11 093 274 910) chọpụta ihe ndị e ji Digoxigenin mee, e jikwa mmiri ọgwụ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, mpịakọta 250)/nitroblue tetrazolium (NBT, mpịakọta 200) tee akụkụ ndị ahụ.