Ọgwụ nje na-arụ ọrụ dị oke mkpa n'ịgwọ ụkọ nri zuru ụwa ọnụ na ịlụso ọrịa mmadụ sitere na vektọ ọgụ. Agbanyeghị, nsogbu na-eto eto nke iguzogide ọgwụ ahụhụ chọrọ ngwa ngwa ịchọpụta ihe ndị ọhụrụ na-elekwasị anya na ihe ndị a na-ejighị nke ọma. Ọwa ndị nwere ike ịnweta ahụhụ (TRPV) nke ụmụ ahụhụ—Nanzhong (Nan) na ndị na-anaghị arụ ọrụ (Iav)—nwere ike ịmepụta ọwa heterologous (Nan-Iav) ma mee ka ha dịrị n'akụkụ akụkụ mechanosensory nke na-akwalite geotropism, ịnụ ihe, na proprioception na ụmụ ahụhụ. Ụfọdụ ọgwụ nje, dị ka aphidopyrrolidone (AP), na-elekwasị anya na Nan-Iav site na usoro a na-amaghị. AP dị irè megide ụmụ ahụhụ na-amịkọrọ mmiri (hemipterans), na-egbochi iri nri site na imebi ọrụ nke eriri. AP nwere ike ijikọ naanị na Nan, mana naanị Nan-Iav nwere ike iso ndị na-eme ihe ike na-akpakọrịta, gụnyere nicotinamide endogenous (NAM), si otú a na-egosipụta ọrụ ọwa. N'agbanyeghị ikike Nan-Iav dị ka ihe a na-atụ anya ọgwụ ahụhụ, a maghị ihe gbasara mgbakọ ọwa ya, ebe njikọ iwu, na iwu Ca2+-dabere na ya, na-egbochi mmepe ọgwụ ahụhụ ọzọ. N'ọmụmụ ihe a, e jiri cryo-electron microscopy chọpụta nhazi nke Nan-Iav na ụmụ ahụhụ Hemiptera na steeti enweghị calmodulin-ligand, yana AP na NAM na ókèala nke ankyrin repeat cytoplasmic domain (ARD). Ihe ijuanya bụ na anyị chọpụtara na protein Nan n'onwe ya nwere ike ịmepụta pentamer, nke mmekọrịta ARD nke AP na-eme ka ọ kwụsie ike. Ọmụmụ ihe a na-ekpughe mmekọrịta molekul dị n'etiti ọgwụ ahụhụ na agonists na Nan-Iav, na-egosipụta mkpa ARD dị na ọrụ na mgbakọ ọwa, yana ịchọpụta usoro nke iwu Ca2+.
N'agbanyeghị mgbanwe ihu igwe zuru ụwa ọnụ nke na-akawanye njọ, nchekwa nri zuru ụwa ọnụ na-akawanye njọ bụ otu n'ime ihe ịma aka kachasị ukwuu nke narị afọ nke 21, yana ihe ndị na-akpata ya na ọha mmadụ.1,2Akụkọ nke Òtù Ahụ Ike Ụwa nke akpọrọ Ọnọdụ Nchekwa Nri na Nri n'ụwa nke afọ 2023 (SOFI) na-eme atụmatụ na ihe dị ka ijeri mmadụ 2.33 n'ụwa niile na-enwe nsogbu nri dị oke njọ ruo n'ókè dị njọ, nke bụ nsogbu dịteworo aka.3,4N'ụzọ dị mwute, a na-eme atụmatụ na ihe dị ka pasent 20 ruo 30 ma ọ bụ karịa nke ihe ọkụkụ na-efu kwa afọ site na ụmụ ahụhụ na nje ndị na-akpata ọrịa, a na-atụkwa anya na okpomọkụ ụwa ga-eme ka iguzogide ụmụ ahụhụ na adịghị ike nke ihe ọkụkụ ka njọ.4,5,6,7,8Mmepe ọgwụ nje dị oke mkpa ọ bụghị naanị iji chebe ihe ọkụkụ pụọ na ụmụ ahụhụ ma belata mgbasa nke nje ndị na-ebute site na vektọ, kamakwa iji lụso ọrịa ndị mmadụ na-ebute site na vektọ dị ka dengue fever, malaria, na Chagas ọrịa ọgụ, bụ́ ndị na-eguzogide ọgwụ nje.5,9,10,11
N'ime ihe ndị bụ isi a na-achọ iji ọgwụ nje na-egbu egbu, ọwa TRPV heterotetrameric Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) na-anọchite anya otu ìgwè ọgwụ ahụhụ a chọtara naanị n'ime afọ iri gara aga, gụnyere ọgwụ ahụhụ ndị a na-ere n'ahịa dịka imidacloprid na pyraclostrobin.12, 13, 14Ọgwụ nje aphidopyrrolifen (AP) nke e mepụtara ọhụrụ ma ree ya n'ahịa, nke ihe mejupụtara ya bụ ọgwụ nje Inscalis®, nke na-ejikọ AP na ọkwa ọrụ subnanomolar.15AP na-egosi obere nsí dị njọ nye ndị na-eme ka ihe ọkụkụ gbasaa, ụmụ ahụhụ bara uru, na ihe ndị ọzọ na-abụghị ihe a na-achọ, ma mgbe ejiri ya dịka ntuziaka akara si dị, ọ nwere ike ibelata nrụgide iguzogide ọgwụ ahụhụ ndị ọzọ.16, 17, 18Nan na Iav kesara nke ọma n'ụdị ụmụ ahụhụ dị iche iche, ha na-egosipụtakwa naanị na akwara ndị na-anabata ihe nke eriri afọ na aka, ha dịkwa oke mkpa maka ịnụ ihe, nghọta ike ndọda, na mmetụta nke ihe.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid, na pyraclostrobin na-akpali usoro Nan-Iav site na usoro pụrụ iche, na-egbochi mmegharị mgbaàmà proprioceptive.13, 16, 23N'ime ụmụ ahụhụ ndị na-amị mkpụrụ (hemipterans) dịka aphids na whiteflies, ọnwụ nke mmetụta uche na-emebi ikike iri nri ha, nke na-eduga n'ọnwụ.13,24N'ụzọ na-adọrọ mmasị, AP na-egosipụta oke mmasị maka mgbagwoju anya Nan-Iav na obere mmekọrịta maka Nan naanị. Njikọ AP na Nan-Iav na-akpali ọkụ eletrik, mana njikọ na Nan naanị anaghị akpali ọrụ ọwa. Iav n'onwe ya anaghị ejikọta na AP ma ọlị.16Nke a na-egosi na Nan na Iav nwere ike ijikọ iji mepụta ụdị Nan-Iav dị iche iche (dịka ọmụmaatụ, yana oke stoichiometric dị iche iche ma ọ bụ ndokwa dị iche iche n'ime otu oke stoichiometric) ma ọ bụ na AP nwere ike ijikọ na ọtụtụ ebe. Ọzọkwa, nicotinamide sitere n'okike (NAM) na-ejikọ na Drosophila Nan-Iav na njikọ micromolar, na-egosipụta mmetụta yiri nke aphids (AP) na vitro.16,25na igbochi mmụba na inye ụmụ ahụhụ aphids nri, nke mechara mee ka ha nwụọ.25,26. Data ndị a na-ewelite ọtụtụ ajụjụ. Dịka ọmụmaatụ, ọ ka edoghị anya otu esi emepụta heterodimer Nan-Iav, ebe njikọ dị iche iche ejiri gbanwee obere molekul, na otu obere molekul ndị a si achịkwa ọrụ ọwa site na igbochi proprioception. Ọzọkwa, ihe kpatara Nan n'onwe ya anaghị arụ ọrụ ma nwee obere mmekọrịta maka AP, ebe heterodimer Nan-Iav na-arụ ọrụ ma na-ejikọ AP na njikọ dị elu, ka edoghị anya. N'ikpeazụ, a maghị ihe gbasara iwu Ca2+-dependent nke ọrụ Nan-Iav na otu esi etinye ya na usoro mgbaàmà neuronal.. 13,21
N'ọmụmụ ihe a, site na ijikọta cryo-electron microscopy, electrophysiology, na usoro njikọ redioligand, anyị kọwara mgbakọ nke Nan-Iav na usoro nke njikọ ya na obere ndị na-achịkwa molekul. Ọzọkwa, anyị chọpụtara calmodulin (CaM) nke ejikọtara na Iav na pentamers Nan nke AP kwadoro. Nsonaazụ ndị a na-enye nghọta dị mkpa na nhazi nke ion calcium na ọwa, mgbakọ ọwa, na ihe ndị na-ekpebi njikọ ligand. Ihe kachasị mkpa bụ na anyị kwadoro na ARD na-arụ ọrụ dị mkpa na usoro ndị a. Ọmụmụ ihe anyị nke ọwa ụmụ ahụhụ zuru oke jikọtara na ọgwụ nje ugbo dị mkpa.27, 28, 29na-emepe ohere maka mmepe nke ụlọ ọrụ ọgwụ ahụhụ, na-eme ka irè na nkọwapụta nke ọgwụ ahụhụ dịkwuo mma, ma na-enye ohere itinye ihe ndị e ji TRPV mee n'ime ụdị anụmanụ ndị ọzọ iji lebara nchekwa nri zuru ụwa ọnụ na mgbasa nke ọrịa ndị sitere na vektọ anya.
Anyị chọpụtakwara na Ca2+ na-achịkwa Nan-Iav, usoro nhazi ahụ na-agakwa n'ihu site na CaM nke ejiri usoro nhazi mee. Ihe dị mkpa bụ na usoro nhazi Ca2+ a nke dabere na Nav site na CaM dị iche nke ukwuu site na usoro nhazi nke ọwa ion ndị ọzọ (dịka ọmụmaatụ, ọwa Na+ nke nwere oghere voltaji na ọwa TRPV5/6)52,53,54,55,56,57Na ọwa Nav1.2, ngalaba C-terminal nke CaM na-ejikọ aka na ngalaba C-terminal (CTD), Ca2+ na-akpali njikọ nke ngalaba N-terminal ya na akụkụ dịpụrụ adịpụ nke CTD56N'ime ọwa TRPV5/6, ngalaba C-terminal nke CaM na-ejikọ na CTH, Ca2+ na-akpalikwa mmụba nke ngalaba N-terminal ya n'ime oghere ahụ, si otú a na-egbochi ikike cation.53,54. Anyị na-atụ aro ihe nlereanya maka ọrụ Nan-Iav-CaM nke Ca2+ na-achịkwa (Foto 4h). N'ihe nlereanya a, ngalaba N-terminal nke CaM na-ejikọ aka na ngalaba C-terminal (CTH) nke Iav. N'ọnọdụ izu ike (njupụta [Ca2+] dị ala), ngalaba C-terminal nke CaM na-emekọrịta ihe na Nan, na-eme ka nhazi ARD sie ike ma si otú a na-akwalite mmeghe ọwa. Ijikọ nke agonist/ọgwụ ahụhụ na ọwa ahụ na-akpali oghere oghere, na-eduga na mmịpụta Ca2+. Ca2+ na-ejikọ na CaM, na-akpata nkewa nke ngalaba C-terminal na ARD nke Nan. N'ihi na igbochi njikọ CaM na-ewepụ mmetụta mgbochi nke Ca2+, nkewa a na-agbanwe mmegharị ARD, si otú a na-akpata mgbochi ma ọ bụ iwepụ mmetụta. Mweghachi ngwa ngwa nke ọwa mmiri mgbe a gbasasịrị calcium ion (Foto 4g) na-egosi na usoro a na-eme ka nzaghachi ngwa ngwa nye akara neuronal Ca2+ na-emekọrịta ihe. Ọzọkwa, a kọwo na mpaghara C-terminal nke Iav, nke a na-aghọtachaghị nke ọma, na-arụ ọrụ ndị ọzọ na nhazi ọwa na iwu dị ugbu a.21
N'ikpeazụ, ọmụmụ ihe anyị na-egosi usoro dị elu nke usoro TRP nke na-egbu ụmụ ahụhụ nke dị mkpa n'ọrụ ugbo—ihe nchọpụta anyị na-amaghị na mbụ. Nke pụtara ìhè bụ na anyị kọwara usoro na ọrụ nke ọwa ụmụ ahụhụ na mkpụrụ ndụ mmadụ (HEK293S GnTi–) kama na mkpụrụ ndụ ụmụ ahụhụ. N'agbanyeghị mmụba nke iguzogide ụmụ ahụhụ na nrụgide na-aga n'ihu na nchekwa nri na nje ndị na-efe efe, ọrụ anyị na-enye ozi dị mkpa nke ga-eme ka mmepe nke ụmụ ahụhụ ọhụrụ dị mfe maka uru nke ahụike mmadụ na nchekwa nri zuru ụwa ọnụ. Ọmụmụ ihe egosila na ọgwụ ahụhụ dị ka AP dị irè megide ụfọdụ ụmụ ahụhụ mgbe ejiri ya dịka ntuziaka akara si dị ma nwee obere nsí dị njọ nye ndị na-eme ka ihe na-amị amị bara uru, na-egosi nchekwa gburugburu ebe obibi ha.13,16Ọzọkwa, nnwale nke ụfọdụ ihe ndị sitere na AP na anwụnta egosila na ha na-efunahụ ikike ife efe. Ịghọta otu ihe ndị a na-agbanwe agbanwe si ejikọta na Nan-Iav ga-eme ka mgbanwe nke ihe ndị dị adị ma ọ bụ mmepe nke ihe ndị ọhụrụ dị mfe maka irè na nke ka mma.kpọmkwemnjikwa ahụhụ. Ọmụmụ ihe anyị na-egosi na njikọ Nan-Iav ARD dị oke mkpa ọ bụghị naanị maka ịchịkwa ọrụ nke ihe ndị dị n'ime ahụ, ọgwụ nje, na Ca2+-CaM, kamakwa maka mgbakọ ọwa. Anyị na-atụ aro na imebi nzukọ heterodimer na obere molekul nwere ike ịbụ ụzọ pụrụ iche ma dị mma maka ịmepụta ihe mgbochi ọwa ion.
N'ime mkpụrụ ndụ ihe nketa asatọ nke orthologous, ahọpụtara mkpụrụ ndụ ihe nketa zuru oke nke anụ aja aja (Halyomorpha halys) Nanchung na Inactive, na-egosi nkwụsi ike dị mma na ihe nhicha. E mere ka mkpụrụ ndụ ihe nketa ndị a haziri ahazi nke ọma maka ngosipụta mmadụ ma tinye ha na pBacMam pCMV-DEST vector (Life Technologies) site na iji ebe XhoI na EcoRI machibidoro. Nke a mere ka klọn ndị ahụ dị na etiti nwere akara C-terminal GFP-FLAG-10xHis na mCherry-FLAG-10xHis, nke HRC-3C protease (PPX) kewaa, na-enye ohere ka ha nwee onwe ha.ngosipụtaIhe ndị e ji kọọ Nanchung na Inactive n'ime vektọ pBacMam bụ ndị a:
E nwetara onyonyo microscopic nke ihe dị iche iche na igwe onyonyo elektrọn nnyefe Titan Krios G2 (FEI) nke nwere igwefoto K3 na ihe nzacha ike Gatan BioQuantum. E tinyere igwe onyonyo a na 300 keV, yana ntọala ike nke 20 eV, nha pikselụ nlele nke 1.08 Å/pikselụ (mmụba aha nke 81,000x), na gradient defocus sitere na -0.8 ruo -2.2 μm. E mere ndekọ vidiyo na okpokolo iri anọ kwa sekọnd site na iji igwe onyonyo Latitude S (Gatan) nke nwere ọnụego dose aha nke 25 e–px−1 s−1, oge mkpughe nke 2.4 s, na ngụkọta dose nke ihe dị ka 60 e–Å−2.
E mere ndozi mmegharị ahụ nke osisi kpatara na ibu nha na fim site na iji MotionCor2 na RELION 4.061. Emere atụmatụ paramita mgbanwe (CTF) na cryoSPARC site na iji usoro atụmatụ CTF dabere na patch62. Ewepụrụ fotomicrographs nwere mkpebi dabara CTF ≥4 Å na nyocha sochirinụ. N'ozuzu, ejiri obere fotomicrographs 500–1000 mee nhọrọ isi na cryoSPARC, wee soro ọtụtụ agba nke nhazi 2D mgbe ehichapụchara iji nweta onyonyo ntụaka doro anya maka nhọrọ mkpụrụ ndụ dabere na template. E mesịa wepụta mkpụrụ ndụ site na iji igbe 64-pixel bonding na binning okpukpu anọ. Emere ọtụtụ agba nke nhazi 2D iji wepụ ụdị mkpụrụ ndụ achọghị. E wughachiri ụdị 3D mbụ site na iji nhazi ab initio ma mee ka ọ dị mma site na iji mmezi na-abụghị uniform na cryoSPARC. Emere nhazi 3D na cryoSPARC ma ọ bụ RELION dabere na heterogeneity ARD. Ahụghị nnukwu ọdịiche dị na ngalaba membrane. E jiri usoro C1 na C2 mee ka ihe ndị ahụ dị ọcha; a na-ewere obere ihe ndị nwere mkpebi C2 dị elu dị ka ihe yiri ya ma e jiri ya tụnyere C2 ma webata ha na RELION maka imeziwanye Bayesian. E wee bufee obere ihe ndị ahụ na cryoSPARC maka imeziwanye ihe na-abụghị otu na imeziwanye mpaghara. E gosiri mkpebi ikpeazụ na ọnụọgụ ihe ndị ahụ na Tebụl 1.
Mgbe anyị na-ahazi pentamers Nan+AP, anyị lere anya n'ụzọ dị iche iche iji melite mkpebi nke ngalaba membrane (karịsịa mpaghara pore), dịka mwepụ ihe mgbaàmà na ikpuchi TMD. Agbanyeghị, mgbalị ndị a agaghị nke ọma n'ihi nsogbu nwere ike ịdị oke njọ na mpaghara pore na ụdị TMD niile. E jiri ihe mkpuchi ihu nke usoro nhazi na-abụghị otu na cryoSPARC mepụta mkpebi ikpeazụ, nke bụ isi na-elekwasị anya na mpaghara ARD. Nke a nwetara mkpebi dị elu karịa nke ngalaba membrane (karịsịa mpaghara VSLD).
E ji Coot63 mepụta ụdị de novo mbụ nke ụdị apo nke ahụhụ Nanchung na Inactive, e jikwa AlphaFold264 mepụta ụdị ahụhụ Nan na Iav iji chọpụta mpaghara ndị nwere obere ntụkwasị obi. E ji usoro Calmodulin mee ihe dabere na nha ahụ siri ike nke ụdị Ca2+-binding na Ca2+-free na PDB accessions 4JPZ56 na 1CFD65, n'otu n'otu. E jiri nhazi gburugburu mee ka ụdị ndị a dị mma iji hụ na stereochemistry ziri ezi na ezigbo geometry. E jiri usoro Phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, na phosphatidylserine mee ihe dị ka njupụta lipid akọwapụtara nke ọma, e tinyekwara ligands NAM na AP na njupụta kwekọrọ na njikọ siri ike. E ji usoro SMILES nke isoforms mepụta faịlụ mmachi site na iji eLBOW na PHENIX66. N'ikpeazụ, e jiri usoro SMILES nke isoforms mepụta faịlụ mmachi na PHENIX site na iji nchọta grid mpaghara na mbelata zuru ụwa ọnụ yana mmachi nhazi nke abụọ. E jiri sava MolProbity mee ihe maka imeziwanye ihe nlereanya na nyocha nhazi, e jikwa PyMOL na UCSF Chimera X mee ihe atụ. E jiri sava HOLE mee nyocha Aperture 67,68,69, e jikwa sava Consurf mee maapụ nchekwa usoro.71
E jiri Igor Pro 6.2, Excel Office 365, na GraphPad Prism 7.0 mee nyocha ọnụọgụgụ. E gosipụtara data ọnụọgụgụ niile dị ka nkezi ± njehie ọkọlọtọ (SEM). E jiri ule t-test nke nwa akwụkwọ (ọdụ abụọ, nke na-enweghị njikọ) tụnyere otu abụọ. E jiri otu ụzọ nyocha nke mgbanwe (ANOVA) wee soro ule Dunnett post hoc iji tụnyere ọtụtụ otu. *P< 0.05, **P< 0.01, na ***PA na-ewere <0.001 dị ka ihe dị mkpa n'ọgụgụ dabere na nkesa data. Ejiri GraphPad Prism 10 gbakọọ uru Kd, Ki, na oge ntụkwasị obi ha nke 95% na-adịghị ahụkebe.
Maka nkọwa ndị ọzọ gbasara usoro ọmụmụ ihe a, biko lee Nchịkọta Akụkọ Nchịkọta Ihe Ndị Dị n'Okike nke dị n'isiokwu a.
E ji ụdị calmodulin sitere na nchekwa data PDB 4JPZ na 1CFD rụọ ụdị mbụ ahụ. E tinyela nhazi ndị a na Protein Data Bank (PDB) n'okpuru nọmba ntinye 9NVN (Nan-Iav-CaM na-enweghị ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM na-ejikọta na nicotinamide), 9NVP (Nan-Iav-CaM na-ejikọ na nicotinamide na EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM na-ejikọ na aphenidolpyrrolline na calcium), 9NVR (Nan-Iav-CaM na-ejikọ na aphenidolpyrrolline na EDTA), na 9NVS (Nan pentamer na-ejikọ na aphenidolpyrrolline). A na-etinye onyonyo cryo-electron microscopy ndị kwekọrọ na Electron Microscopy Database (EMDB) n'okpuru nọmba ntinye ndị a: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM na-enweghị ligand), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM complex na nicotinamide), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM complex na nicotinamide na EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM complex na aphidopyrrolline na calcium), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM complex na aphidopyrrolline na EDTA), na EMD-49849 (Nan pentamer complex na aphidopyrrolline). E gosipụtara data dị mkpa maka nyocha ọrụ na akwụkwọ a.
Oge ozi: Jenụwarị-28-2026